26-07-2019
0 Просмотров
0 комментариев
0 РейтингСы́воротка кро́ви — плазма крови, лишённая фибриногена. Сыворотки получают либо путём естественного свёртывания плазмы (нативные сыворотки), либо осаждением фибриногена ионами кальция. В сыворотках сохранена большая часть антител, а за счёт отсутствия фибриногена резко увеличивается стабильность.
Сыворотку выделяют при анализе крови на инфекционные заболевания, при оценке эффективности вакцинации (титр антител), а также при биохимическом анализе крови.
Имму́нные сы́воротки (антисы́воротки) — сыворотки крови, содержащие антитела против определённых антигенов. Их вводят больному в лечебных целях или в качестве временной защиты (для создания пассивного иммунитета) от различных заболеваний [1] . Иммунные сыворотки используют в качестве лекарственных препаратов при многих инфекционных заболеваниях (столбняке, дифтерии, гриппе) и отравлениях (яды змей, ботулотоксин). Метод лечения кровяными сыворотками (серотерапию) разработали в конце XIX века Эмиль Адольф фон Беринг, Китасато Сибасабуро, Эмиль Ру и Александр Йерсен.
Сыворотки, меченые ферментами, радионуклидами и люминофорами применяют в диагностике некоторых заболеваний и в научных исследованиях.
Выполните получение сыворотки, плазмы крови без следов гемолиза.
Для предотвращения гемолиза крови следует учитывать следующее:
•соразмерное сдавление вен при наложении жгута, время наложения жгута — не более 1-2 минуты;
•взятие крови из вен острыми иглами с коротким срезом, достаточно большого диаметра;
•перенесение крови из шприца в пробирку осуществляется сразу после взятия, не допуская вспенивания. При этом необходимо снять иглу со шприца;
•взятие крови осуществляется в химически чистые сухие пробирки без примесей детергентов, моющих средств, воды;
•исключить: сильное нагревание или переохлаждение, задержку транспортировки в лабораторию, длительное встряхивание при транспортировке либо перемешивание.
Пастроение калибровочного графика
Построение колибровачной кривой начинается с приготовления арифметического ряда разведений с последующей обработкай стандартных растворов аналогично опытным пробам.
И для каждой рабочей концентрации стандартного вещества нужно сделать 3-5 фотометрических определений. Усредненные (соответствующие отдельным концентрациям)значения оптической плотности(абсорбции,экстинции)наносят на милиметровую(калибровачную)бумагу.На оси обцисс(горизантальной)с соблюдением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе,на оси ординат(вертикальной)-соответствующие им величины абсобции.
Зависимость между двумя сопоставляемые величинами отражается линией ,построенной уже по трем точкам замера. Однако строить калибровачный график следует не менее по 5 точкам.Калибровачная кривая прокладывается(тонко отточенным карандашом,желательно с помощью позрачной линейки,таким образом ,чтобы по возможности большее числоточек(например 3и5)лежало на линии,а только распологалось близ нее,равномерно отклоняясь в ту и другую стороны.Отдельные точки,значительно смещающиеся от калибровачной кривой и обычно явл яющиемся результатом грубой ошибки в определении ,исключается из учёта.Точки принято обозначать крестиками.
Расположение кривой определяют так, чтобы бы она исходила из нулевой метки под углом 45 градусов к осям кординат. Для этого значений концентраций и соответствующих
Выполните тимоловую пробу. Укажите нормы.
Принцип метод базируется на образовании глобулин-тимол-липидного комплекса, вызывающего появление мутности при взаимодействии сыворотки с тамоло-вероналовым буфером.
Ход определения,
К 6 мл тимолово-вероналового буфера + 0,1 мл негемолизированной сыворотки, содержимое пробирки перемешивают, оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре (18—25 °С) и затем фотометрируют при 670 нм (630—690 им) против контрольной пробы тимолово-вероналового буфера в кювете 10 мм.
Фактор пересчета = 30.
Норма тимоловой пробы 0—4 ед. S-H
Выполните определение общего белка в сыворотке крови. Укажите нормы.
Принцип метода. Белки в щелочной среде образуют с ионами меди окрашенные в фиолетовый цвет комплексы (биуретовая реакция).
Анализ сыворотки крови. В пробирки помещают 0,02 мл сыворотки крови и 1,0 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Через 30 мин. измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 540-560 нм против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,05 мл физиологического раствора. Расчет: Соп = Аоп * F. Фактор = 180.
Нормальные величины:
Взрослые и дети 65-85 г/л, дети до 3 лет – 54-87 г/л, новорожденные – 52-91 г/л
Выполните определение альбумина в сыворотке крови. укажите нормы.
Принцип метода. При взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс сине – зеленого цвета. Чем ярче сине-зелёный цвет тем больше концентрация.
Проведение анализа. В пробирки помещают 0,01 мл сыворотки крови и 1,0 мл рабочего реактива, тщательно перемешивают, избегая образования пены. Через 5-10 мин. измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 670-690 нм против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,01 мл дистиллированной воды. Окраска стабильна в течение 8 ч.
Расчет: Con = Aon* F, где Con — концентрация альбумина (г/л), F — усредненный фактор.
Нормальные величины: сыворотка 35 -50 г/л, новорожденные 28—44 г/л.
Выполните определение СРБ в сыворотке крови. укажите нормы.
Принцип метода.СРВ латекс реагент представляет собой суспензию латексных частиц, 1 на поверхности которых иммобилизированы антитела против С-реактивного белка человека. При смешивании данного реагента с сывороткой, содержащей СРБ в концентрации превышающей 6 мг/л, в результате специфической реакции между антителами к СРБ и С-реактивным белком, развивается агглютинация латексных частиц. Агглютинация определяется визуально, что свидетельствует о положительной реакции пробы. Для полуколичественного определения анализируется последовательные разведения сыворотки. Об уровне СРБ судят по последнему разведению (титр), при котором была выявлена визуально определяемая агглютинация.
1. Качественная реакция определения СРБ.
Внести в лунки тест-пластины по 20 мкл исследуемых образцов и реагентов, используя каждый раз одноразовые наконечники пипеток следующим образом: в лунки №№1-10 – исследуемые образцы сыворотки, в лунку (+) – реагент №2 (положительный контроль), в лунку (-) – реагент №3 (отрицательный контроль).
Рядом с первой каплей во всех лунках поместить по 20 мкл реагента №1 (латекс-суспензия). Смешать содержимое двух капель до гомогенного состояния. Плавно покачивать тест-пластину в течение 2 минут. Развитие процесса агглютинации необходимо наблюдать в промежутке со 2-ой по 3-ю минуту от момента начала покачивания тест-пластины. Сравнить степень агглютинации в лунках с реагентами №2, №3, со степенью агглютинации исследуемых проб
Расчет. Четко видимые агрегаты латексных частиц свидетельствуют о концентрации CPБ>6 мг/л, мелкие агрегаты – о концентрации близкой к 6 мг/л, равномерно гомогенная молочная суспензия указывает на концентрацию СРБ ниже 6 мг/л – результат отрицательный.
Норма: до 6 мг/л
Выполните определение мочевины в сыворотке крови и моче ферментативным методом. Укажите нормы.
Принцип метода. Уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. Выделившийся аммиак определяется фотометрически по окрашенному продукту химической реакции.
Методика анализа. Длина волны 590 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм. Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1 : 100 и результат умножают на коэффициент разведения (100). Опытная проба: 0,02мл проба биожидкости + 0,50 мл раствора 1. Калибровочная проба: 0,02 мл калибровачный раствор + 0,50 раствор1. Холостая проба: раствор1 0,50 мл.
Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 10 мин. при 37 °С. Затем последовательно добавляют раствор 2 и раствор 3 по 1 мл в каждую пробу и повторно инкубируют 5 мин. при 37 °С или 15 мин. при комнатной температуре.
Фактор пересчета = 13.
Нормальные величины: мочевина в сыворотке крови – 2,61 – 8,35 ммоль/л; мочевина в суточном объеме мочи – 333,0 – 582,8 ммоль/л.
Билирубин
Принцип метода.В основу метода положена реакция взаимодействия диазотированной сульфаниловой кислоты со связанным билирубином сыворотки. По интенсивности окраски судят о концентрации прямого билирубина. При добавлении к сыворотке кофеинового реактива, несвязанный билирубин переходит в растворимое состояние, благодаря чему он также дает окраску раствора со смесью диазотиреактивов. По интенсивности этой окраски фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным находят содержание несвязанного билирубина.
Методика анализа.Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и диазореактива 2 и получают диазосмесь. В три пробирки (для определения общего, прямого и постановки контрольной пробы реакции на цвет сыворотки) вводят компоненты набора:
Общий билирубин: сыворотка 0,5 + кофеиновый реактив 1,75 + диазосмесь 0,25.
Связанный билирубин: сыворотка 0,5 + физраствор 1,75 + диазосмесь 0,25.
Контрольная проба: сыворотка 0,5 + кофеиновый раствор 1,75 + физраствор 0,25.
При определении общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин. при дальнейшем стоянии пробы окраска не изменяется. Для исследования связанного фотометрирование осуществляется спустя 5-10 мин после добавления диазосмеси, т.к. при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин. Контрольную пробу на мутность сыворотки ставят для каждой опятной пробы. Измерение проводят при длине волны 500-560нм. Расчет – по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л, разница между ними составляет величину несвязанного.
Норма: Общий билирубин 8,55-20,52 мкмоль/л
Связанный2,1-5,1 мкмоль/л
Несвязанный 6,45-15,42 мкмоль/л
Выполните расчет коэффициента атерогенности (КА).
В клиническую практику введено правило расчёта отношения всех липопротеинов к антиатерогенным. Отражением этого является КА (соотношение между ХС, входящим в состав всех липопротеинов, кроме ЛПВП). Отсюда и формула коэффициента по А. Н. Климову: КА = ОХС – ХС ЛПВП /ХС ЛПВП. где ОХС – это общий ХС, т.е. весь ХС, содержащийся в плазме крови, во всех липопротеинах, а ХС ЛПВП – это ХС, входящий в состав единственного антиатерогенного класса липопротеинов, т.е. "хороший ХС". А разница между общим ХС и "хорошим ХС" и есть весь "плохой ХС". Т.е. коэффициент атерогенности – это есть по сути отношение всего плохого ХС ко всему хорошему ХС. Значит: чем выше значения коэффициента, тем больше плохого ХС и меньше хорошего, и тем выше риск атероклероза. Этот показатель должен быть в пределах 3—3,5. В норме у здор мужчин в возрасте 40—60 лет без клинич признаков атеросклероза он колеблется от 3 до 3,5. У лиц с ИБС он обычно более 4. При КА 3-4 имеется умеренная вероятность развития атеросклероза, при величине более 4-х – высокая вероятность. У лиц с сильно выраженным атеросклерозом этот коэффициент может достигать 7единиц и более. При высоких значениях КА часто требуется лечение холестерин понижающими препаратами, диета. Многое зависит и от других параметров.
Выполните получение сыворотки, плазмы крови без следов гемолиза.
Для предотвращения гемолиза крови следует учитывать следующее:
•соразмерное сдавление вен при наложении жгута, время наложения жгута — не более 1-2 минуты;
•взятие крови из вен острыми иглами с коротким срезом, достаточно большого диаметра;
•перенесение крови из шприца в пробирку осуществляется сразу после взятия, не допуская вспенивания. При этом необходимо снять иглу со шприца;
•взятие крови осуществляется в химически чистые сухие пробирки без примесей детергентов, моющих средств, воды;
•исключить: сильное нагревание или переохлаждение, задержку транспортировки в лабораторию, длительное встряхивание при транспортировке либо перемешивание.
Последнее изменение этой страницы: 2016-07-14; Нарушение авторского права страницы
Исследования крови следует проводить при одинаковых условиях. Таковые обеспечиваются при взятии крови утором, за 2-3 часа до кормления животных. У крупных сельскохозяйственных животных кровь берут в стоячем положении, в специальном станке или в стойле. Беспокойных животных фиксируют на месте с помощью закруток и носовых зажимов, а пугливым животным завязывают глаза. У мелких животных взятие крови лучше производить, привязав их к столу или специальному станку. Для фиксации птиц разработаны специальные приспособления и столики. Для фиксации кур и уток предназначено устройство УФКУ-1. Оно состоит из металлического корпуса, в дне которого имеются пазы для фиксации крыльев, а на бортах вырезаны полукруглые желоба для фиксации ног с помощью планок и крючков. Птицу кладут на дно корпуса в спинном положении. Аналогичное устройство (СРФ-1) несколько больших размеров применяют для фиксации гусей и индеек. Оно выполнено в виде переносного стола на раздвижных опорах, который легко можно использовать в полевых условиях. При взятии крови из сердца птицу фиксируют на столе в спинном положении. В одну руку забирают обе ноги и оба крыла, а второй рукой берут голову и опускают ее ниже края стола. В таком положении птица находиться неподвижно, а зоб не мешает взятию крови.
На участке кожи, где предполагается произвести взятие крови, обязательно выстригают шерсть, кожу очищают спиртом или эфиром и насухо вытирают.
Следует всегда обращать внимание на то, чтобы кровь для исследования употреблялась только жидкая, свежевыпущенная, При взятии крови место укола нельзя сжимать и сдавливать, в противном случае в вытекающую кровь попадает тканевая жидкость, влияющая на показания исследования.
Повторное взятие крови для исследования из тех мест, где ранее уже бралась кровь, не рекомендуется. В случаях, когда получение крови из укола или разреза кожи затруднено вследствие плохого её вытекания, следует новое место разреза натереть эфиром или ксилолом и высушить ватой. После указанной манипуляции почти всегда удаётся получить кровь.
Небольшое количество крови у лошадей и крупного рогатого скота берут из вены угла глаза. Для этого нажатием пальца кровь задерживают в вене, которую прокалывают иглой. Обычно же кровь у крупного рогатого скота, свиней, коз, овец, собак, кошек берут из сосудов внутренней или наружной поверхности уха при помощи небольшого разреза скальпелем. Получение крови возможно также путём надреза края уха. У кроликов кровь получают из ушной вены, у морских свинок – из сердца, иглами соответствующего диаметра и длины. У крупного рогатого скота кровь можно взять также из разреза ножницами хвостовой складки. У верблюдов кровь берут из разреза или прокола кожи на горбе. У крыс и мышей кровь получают из хвоста, отрезая кончик его, после предварительного очищения и нагревания компрессом до 37- 40°С.
У птиц кровь получают из кожного разреза на гребне или берут из V. cutanea ulnaris или a. brachialis. Для этого на внутренней стороне крыла, над локтевым сочленением удаляют несколько перьев и слегка надрезают сосуд скальпелем или маленькими ножницами. Кровь у гусей берут из крыловой вены. Она расположена с внутренней стороны крыла и идет вдоль плечевой кости. Она хорошо заметна, так как является самым крупным сосудом в этой области. При фиксации птицу держат жестко за ноги, заворачивая голову за одно крыло и оттягивают другое крыло. Место взятия крови ближе к локтевому суставу, очищается от пуха, кожу дезинфицируют спиртом, и прокалывают вену, направляя иглу вдоль вены срезом вверх. Кровь легко стекает. Место укола тампонируется. Недостатком этого метода может является обильное кровотечение, которое бывает трудно остановить, особенно при высокой окружающей температуре. В области плеча, в месте расположения вены, подкожная клетчатка довольно рыхлая, что способствует легкому развитию гематом.
Для получения больших количеств крови прибегают к пункции вен. У лошадей, крупного рогатого скота, коз, овец и верблюдов кровь берут из яремной вены. На месте, где предполагается произвести прокол, выстригают шерсть и кожу дезинфицируют спиртом или 5%-ным раствором йода. Кровопускательную иглу предварительно кипятят в течение 5-10 минут. Для взятия крови большим пальцем левой руки нажимают на вену у основания, с левой стороны шеи. Задержка оттока крови вызывает набухание вены. Набухшая вена видна в виде толстого шнура. Кровопускательную иглу берут в правую руку, вводят под острым углом по направлению к голове и продвигают в полость сосуда. В случае, если кровь не будет вытекать, рекомендуется повернуть иглу вокруг её продольной оси и слегка продвинуть вперёд или назад. Во избежание образования гематомы при извлечении иглы из вены одновременно прекращают ее сдавливание.
У свиней в больших количествах кровь получают из хвоста, отрезая его кончик.
У птицы кровь в больших объемах берется из сердца. Получить кровь из сердца несколько сложнее, чем из гребня и из вены, и для этого необходим определенный навык. Кровь из сердца берут шприцем на 10 или 20 см3 с помощью толстой или тонкой иглы. Большим пальцем левой руки нащупывают углубление около краниальной части грудной кости, под углом 45° прокалывают иглой кожу и лежащие под ней ткани, попадая в грудобрюшную область. Затем иглу со шприцем переводят в горизонтальное положение, продвигают внутрь полости на несколько сантиметров. При попадании иглы в сердце ощущается сердцебиение, и кровь, пульсируя, попадает в шприц.
Порядок взятия крови для исследования должен быть следующим: стирают первую каплю, затем набирают кровь в капилляр для определения гемоглобина; далее берут кровь в смеситель для подсчёта лейкоцитов, потому что требуется сравнительно большое количество крови, затем в смеситель для подсчёта эритроцитов и, наконец, на предметных стёклах делают мазки и толстую каплю. После каждой манипуляции остатки крови стирают ватой.
Если взятие крови происходит одновременно у нескольких животных, то удобно пользоваться фотографическими ванночками или фанерой с укреплением меланжеров и стёкол, разложенных на каждое животное.
Цельная кровь, вышедшая из кровеносных сосудов, обладает способностью быстро сворачиваться, поэтому её необходимо стабилизировать антикоагулянтам. В настоящее время один из лучших антикоагулянтов – гепарин, так как использование других антикоагулянтов приводит к некоторому разбавлению крови, что в дальнейшем приходиться учитывать при проведении исследований. Гепарина, в отличие от других антикоагулянтов, достаточно 1 капли на 5 мл крови. Практически намного удобнее наливать в пробирку немного гепарина, смачивать им стенки пробирки и переливать в другую пробирку. Обработав необходимое число пробирок, остаток гепарина сливают.
Работая с цельной кровью, следует учитывать, что это живая ткань и в ней обязательно происходят – пусть и не столь интенсивно, как в организме, процессы обмена. Поэтому все гематологические исследования, проводимые с использованием цельной крови, должны проводиться в минимально короткие сроки. Стабилизированная кровь после длительного отстаивания или центрифугирования разделяется на форменные элементы (внизу пробирки) и плазму (вверху).
Сыворотка – жидкая часть крови, остающаяся после удаления из нее форменных элементов и белка фибрина. Она используется в биохимических и серологических исследованиях. Для получения сыворотки кровь берут в стерильные пробирки, вымытые в растворе мыла и промытые дистиллированной водой. Сыворотка лучше отделяется, если перед взятием крови стенки пробирок смочить теплым физиологическим раствором. Пробирки должны иметь комнатную температуру, так как кровь плотно пристает к стенкам пробирок и наступает частичный гемолиз эритроцитов. Кровь ставят в термостат при температуре 35°С на 1 час. Затем переносят ее на холод. Через 4 часа сыворотка в виде прозрачной жидкости отделяется от кровяного сгустка. Для лучшего выделения сыворотки образовавшийся сгусток фибрина отделяют от стенок пробирок, обводя стеклянной палочкой или проволокой. С целью быстрого получения сыворотки свернувшуюся кровь центрифугируют при 2000-2500 об/мин. в течение 15-20 минут. Готовую сыворотку сливают в чистую сухую пробирку.
Для взятия крови на сыворотку у птицы используются узкие пробирки, так как в отличие от других млекопитающих, у них ретракция кровяного сгустка относительно мала, и сыворотка отделяется в небольших количествах. После взятия крови пробирки наклоняют под углом 60 градусов. При вертикальном положении пробирок сыворотка отделяется значительно хуже. Вскоре после образования кровяного сгустка его обводят тонкой металлической иглой для лучшего отделения сыворотки. Пробирки на час помещают в термостат. Сыворотку сливают. Если попали эритроциты, ее центрифугируют на 1000-1500 оборотах в течение 10-15 минут.
В сыворотке содержится много различных органических соединений, поэтому ее, так же, как и цельную кровь, желательно исследовать сразу после получения. При необходимости более длительного хранения сыворотки ее можно консервировать. В качестве консервантов применяют мартиолят, тимол, борную кислоту и другие вещества. Консервант добавляется в очень малых количествах. Сыворотка также хорошо сохраняется при глубоком замораживании. В этом случае сыворотку разливают малыми порциями (по 1 мл), замораживают и хранят при – 20°С, по мере необходимости используя в работе.
Для получения плазмы крови в пробирку предварительно насыпают лимоннокислый натрий (из расчета 15-20 мг на 10 мл), щавелевокислые натрий, калий или аммоний (из расчета 30-15 мг на 10 мл). Можно использовать гепарин в виде порошка в количестве 2 мг на 10 мл крови. Взятую в пробирку кровь быстро и хорошо смешивают с порошком. Плазму отделяют от форменных элементов отстаиванием или центрифугированием в течение 15-20 минут при 2000-2500 об/мин.
Для того, чтобы путем гематологических исследований выявить разнообразные изменения, необходимо соблюдать ряд общих правил, иначе полученные результаты будут не верны.
Прежде всего, инструментарий и посуда для взятия крови и проведения исследований, должны быть безукоризненно чистыми, хорошо обезжиренными и простерилизованными. Для мытья пробирок и прочей стеклянной посуды лучше всего использовать раствор двухромовокислого калия в концентрированной серной кислоте (около 1%). Следует иметь в лаборатории заготовленный заранее насыщенный водный раствор двухромовокислого калия, который разводится концентрированной серной кислотой в соотношении 1:3 (разводить следует очень осторожно, так как жидкость сильно нагревается). В дальнейшем ей можно пользоваться в остывшем виде, пока она не изменит коричневато-красного цвета на зеленоватый.
Резиновые пробки идут с тальковым покрытием, поэтому их необходимо промывать в воде для удаления порошка. Затем пробки кипятят 5 минут в растворе разбавленной щелочи (0,5 н раствор), которую затем отмывают водой. Снова кипятят 5 минут в разбавленной соляной кислоте (1:25) и промывают в проточной воде до нейтральной реакции стекающей жидкости. После удаления покрывающего порошка резиновые пробки очень быстро портятся, поэтому их нельзя готовить много, а очистка производится по мере необходимости, для непосредственного применения. Хранить пробки лучше всего в прохладном месте, в плотно закрытой банке. Это особенно важно в летний период.
Следует также учитывать, что при исследовании крови приходиться работать с очень малыми количествами материала. Поэтому приступая к новым исследованиям, необходимо предварительно получить навык в соответствующем методе, причем обучение проводиться на чистых растворах, с известной концентрацией. Только после этого можно приступать к практическим исследованиям. Опыт и навык в микрометодике имеют еще большее значение, чем при обычных химических исследованиях.
Все исследования следует проводить посредством двух параллельных определений, из которых затем выводится средняя величина. Если расхождение между определениями велико, исследование следует считать неудавшимся и провести повторное.
