Система ab0 группы крови

Клиники Санкт-Петербурга, где выполняется данный анализ для взрослых (228)

Клиники Санкт-Петербурга, где выполняется данный анализ для детей (129)

Описание

На мембране эритроцитов человека содержится большое количество антигенных структур, точное количество которых до сих пор не известно. Термин «группа крови» характеризует определенное сочетание врожденных антигенных свойств эритроцитов (групповых факторов) и антител к ним, находящихся в плазме (сыворотке) крови.

Определение групповой принадлежности имеет решающее значение при переливании донорской крови, поскольку попадание в организм неодногрупной крови приводит к тяжелым и смертельным для рецепиента осложнениям. И хотя на сегодняшний день изучены и охарактеризованы десятки групповых антигенных систем крови (Даффи, Келл, Кидд, Льюис и т.д), в клинической практике используется определение двух основных систем антигенов – AB0 и резус-фактора, поскольку несовместимость по другим группам не вызывает такого выраженного иммунного ответа.

Общие сведения о системе AB0

По системе AB0 на мембране эритроцитов находится два антигена (агглютиногена) А и В, а в плазме крови два вида антител (агглютининов) – альфа (анти-А) и бета (анти-В). По наличию в крови человека комбинации перечисленных агглютиногенов и агглютининов выделяют 4 группы крови:

В связи с отсутствием антигенов на эритроцитах, людей с I(0) группой крови принято считать универсальными донорами, а людей с IV (AB) группой крови, в связи с отсутствием антител в плазме, универсальными реципиентами.

Наследование групп крови по системе AB0

Групповая принадлежность крови наследуется по определенным генетическим закономерностям, и в дальнейшем не меняется в течение жизни человека. Некоторые, наиболее очевидные закономерности наследования, приведены ниже:

Методы определения группы крови

Все основные методы определения групповой принадлежности по системе AB0 основаны на реакции антиген-антитело, приводящей к агглютинации (т.е. к склеиванию эритроцитов и выпадению характерного осадка) исследуемой крови. В качестве основного реагента при проведении исследования выступает собственно кровь или плазма человека, группу крови которого нужно определить. Кровь смешивается со стандартными гемагглютинирующими сыворотками (готовятся из донорской крови) или так называемыми моноклональными антителами (цоликлонами), содержащими альфа и бета агглютинины. Плазма смешивается со стандартными эритроцитами (тоже готовятся из донорской крови), содержащими агглютиногены A или B.

В этой статье речь пойдёт о методах определения группы крови по системе АВ0, а также об экспресс-методе определения резус-фактора.

Сначала поговорим о целях определения группы крови, а также об истории изучения этого вопроса. Интерес к переливанию крови зародился давно. Ещё в Древнем Египте врачи пытались перелить её раненым, больным, умирающим. В основном использовали в качестве доноров молодых животных. Считалось, что они обладают особой природной силой и к тому же не подвержены порокам, как люди. Переливание от человека человеку было чаще всего безуспешным. Причины этого гораздо позже открыл австрийский врач Карл Ландштейнер. Он определил, что у человека находятся различные антигены и антитела, образующие особую иммунную систему.

В настоящее время выделено около пятисот различных антигенов, но на практике группы крови определяют по системе АВ0.

По этой системе в состав крови входят:

• агглютиногены А и В (антигены). Локализация – эритроциты;
• агглютинины альфа и бета (антитела). Локализация – сыворотка.

Расположение их в крови:

• Антиген А вместе с антителами альфа;
• Антиген В вместе с антителами бета;
• Только антитела альфа и бета.

Одновременно одноимённые антигены и антитела находиться не смогут, так как их встреча приводит к бурному проявлению т.н. реакции изогемагглютинации, что приведёт к гемолизу (разрушению) эритроцитов и прочим патологическим реакциям.

Техника определения группы крови состоит в применении знания этой особенности.

• 1-я группа: отсутствуют агглютиногены, в сыворотке – агглютинины есть;
• 2-я группа: есть А и бета;
• 3-я группа: есть В и альфа;
• 4-я группа: есть А, В, агглютининов нет.

Техника определения

Техника определения группы крови по системе АВ0 основана на визуальном наблюдении агглютинации.

Проводить исследование нужно при:

Анна Поняева. Закончила нижегородскую медицинскую академию (2007-2014) и Ординатуру по клинико-лабораторной диагностике (2014-2016).Задать вопрос>>

• средней температуре воздуха 20°С;
• нормальной влажности;
• хорошем освещении;
• достаточном количестве времени на работу.

Несоблюдение этих условий приведёт к искажению результата.

На специальном планшете пишут фамилию исследуемого. Сам планшет разделяется на 3 сектора, по часовой стрелке: 1-я группа, 2-я, 3-я. Затем так поступают со вторым планшетом. На столе должны находиться: 2 комплекта стандартных гемагглютинирующих сывороток 1-й, 2-й и 3-й групп. Эти комплекты должны быть разных серий, с наклеенными этикетками, неповрежденные, без осадка, храниться в холодильнике. Каждый флакон нужно проверить. Также должна быть сыворотка 4-й группы крови. Дополнительно рядом находятся: иголка или шприц, бинты, дезинфицированная вата, этанол, предметные стекла, флакон физиологического раствора.

Сделав прокол пальца (можно брать и из вены), сначала появившуюся кровь вытирают стерильной ватой, следующие капли наносят на предметное стекло, затем на эти три сектора тарелки. Перед этим в планшеты должны быть добавлены стандартные сыворотки из двух разных комплектов. Объём добавляемой крови должен быть меньше объёма сыворотки.

Планшет с образцами немного трясут.

После этого добавляют физраствор, снова трясут, минут через пять делают вывод о группе крови в зависимости от следующих возможных результатов:

1. Агглютинации нет нигде. Значит, образец имеет 1-ю группу.
2. Агглютинация есть в секторах с 1-й и 3-й группой, нет — на 2-м секторе – исследуемый образец 2-й группы.
3. Реакция есть в 1-м и 2-м секторе, но нет на 3-м. Исследуемый образец – 3-й группы.
4. Реакция во всех трёх секторах, значит у человека 4-я группа. Но необходима дополнительная проверка со стандартной сывороткой 4-й группы. Если реакции и там нет, исследование точно.

Реакция гемагглютинации довольно характерна. Она имеет вид свернувшихся хлопьев, образовавшихся из белых комочков, быстро обесцвечивается.

Плюсы данной методики:

• Низкая стоимость;
• Распространённость;
• Надежность.

Минусы

• Сложность;
• Необходимость создания особых условий работы.

Определение моноклональными антителами

Для этого используют особые реагенты – цоликлоны. Они представляют собой клоны антител, полученных из клеточного гибрида, и способны вступать в реакцию с антигенами образца.

Выпускаются в виде порошка, который нужно развести в физиологическом растворе.

Техника проведения:

1. На планшете размечают два сектора: анти-А и анти-В;
2. На каждый сектор соответственно наносят каплю цоликлонов А и В;
3. Рядом с каплей размещают каплю анализируемой крови;
4. Перемешивают.

Трактовка результатов в соответствии с наступившей агглютинацией или ее отсутствием:

С Анти-А — С анти-В: Результат (группа крови)

• нет — нет: 1-я
• есть — нет: 2-я
• нет — есть: 3-я
• есть — есть: 3-я

Плюсы метода:

• Быстрота;
• Несложная трактовка результата;
• Лёгкая обучаемость персонала.

Минусы:

Определение с помощью стандартных эритроцитов

Методика похожа на метод определения с помощью сывороток, но рядом на секторах наносят каплю реагентов стандартных эритроцитов – с заранее известными агглютиногенами, выделенными из донорской крови. Далее оценивают результат:

1. Агглютинация есть со стандартными эритроцитами 2-й и 3-й групп – исследуемый образец относится к 1-й группе;
2. Агглютинация есть со стандартными эритроцитами только 3-й группы – исследуемый образец относится ко 2-й группе;
3. Агглютинация есть со стандартными эритроцитами только 2-й группы – исследуемый образец относится к 3-й группе;
4. Агглютинации нет нигде – исследуемый образец относится к 4-й группе.

Исследование проводится со стандартными эритроцитами одновременно, на одной планшетке.

Плюсы метода:

Минусы:

• Более высокая стоимость;
• Подходит большой оснащённой лаборатории;
• Необходимость обучения персонала.

Техника обнаружения наличия или отсутствия резус-фактора

Помимо группы крови, специфичным признаком крови является резус-фактор (Rh). Это особый белок, расположенный на эритроцитах.

Ошибки в его определении могут привести к патологическим реакциям в организме, а именно — к резус-конфликту.

Резус можно определить экспресс-методом. Суть заключается в следующем: на планшетке обозначают два сектора. Первый для сыворотки антирезус, второй для контрольной. Сыворотка представляет собой реактив с анти-Rh антигеном 4-й группы крови, разведённым в альбумине. Контрольная не содержит резус-фактор. Наносят обе капли из этих реактивов на эти сектора, затем добавляют кровь. Объемы должны быть равным. Палочкой размешивают, добавляют немного физраствора. Результаты:

• Агглютинация слева – кровь резус-положительна;
• Агглютинации слева нет – кровь резус-отрицательна;
• Агглютинация сразу в двух секторах – реакция сомнительна, необходимо перепроверить результат.

Достоверность методов достигает 100%, при условии проведения контрольных исследований и правильной организации работы.

Возможные ошибки при проведении исследований

Технические:

• Нарушения климатического режима помещения;
• Слишком короткое время наблюдения;
• Слишком длинное время наблюдения;
• Осадок выпавшего фибрина;
• Неправильная организация работы.

Биологические:

• Некоторые заболевания, влияющие на физико-химический состав крови;
• Неспецифическая агглютинация;
• Свёртывание крови из-за выпадения фибрина;
• Наличие подгрупп крови у донора.

Ошибки, зависящие от особенностей эритроцитов:

• Слишком большая скорость агглютинации (из-за некоторых заболеваний – ожоговая болезнь, сепсис);
• Необычный состав эритроцитов (обычно генетически обусловленный);
• Неспецифическая агглютинация образца (при аутоиммунных заболеваниях, гемолитической болезни новорождённых);
• Снижение способности агглютинировать – при лейкозе;
• Присутствие кровяных химер – на разных эритроцитах разные антигены.

Ошибки, зависящие от сыворотки:

• Истёкший срок годности;
• Неправильное хранение;
• Маленький титр (должен быть 1:32);
• Возникновение феномена Томсена – неспецифической агглютинации. Встречается при попадании бактерий.

Ошибки, связанные с применением неполноценных стандартных эритроцитов и сывороток:

• Нарушение технологии проведения исследования;
• Ошибка в наклеивании этикетки и фасовки.

• Некомпетентный персонал;
• Нарушения в заборе образца крови;
• Попадание в образцы крови вирусов, бактерий;
• Неправильное использование вспомогательных предметов – планшетов и др.

Определение группы крови показано на видео

Вывод

Определение группы крови по системе АВ0 — это один из самых частых видов исследований.

Проводится он в лабораториях обученным квалифицированным персоналом.

Накоплен большой опыт, отработаны различные методики в области анализа группы крови человека.

В плазме крови человека могут содержаться агглютинины ? и ?, в эритроцитах — агглютиногены A и B, причём из белков A и ? содержится один и только один, то же самое — для белков B и ?.

Таким образом, существует четыре допустимых комбинации; то, какая из них характерна для данного человека, определяет его группу крови:

A и B: четвёртая

В клинической практике определяют группы крови с помощью моноклональных антител. При этом эритроциты испытуемого смешивают на тарелке или белой пластинке с каплей стандартных моноклональных антител (цоликлоны анти-А и цоликлоны анти-B, а при нечеткой агглютинации и при AB(IV) группе исследуемой крови добавляют для контроля каплю изотонического раствора. Соотношение эритроцитов и цоликлонов:

0,1 цоликлонов и

0,01 эритроцитов. Результат реакции оценивают через три минуты.

Резус-фактор – это антиген (белок), который находится на поверхности красных кровяных телец (эритроцитов). Он обнаружен в 1919 г в крови обезьян, а позже – и у людей. Резус-фактор играет важную роль в формировании так называемой гемолитической желтухи новорожденных, вызываемой вследствие резус-конфликта кровяных телец иммунизованной матери и плода. Известно, что резус-фактор – это сложная система, включающая более 40 антигенов, обозначаемых цифрами, буквами и символами. Чаще всего встречаются резус-антигены типа D (85 %), С (70 %), Е (30 %), е (80 %) – они же и обладают наиболее выраженной антигенностью. Система резус не имеет в норме одноименных агглютининов, но они могут появиться, если резус-отрицательному человеку перелить резус-положительную кровь.

Правила переливания крови:

Перед каждым переливанием крови необходимо: 1) установить группу крови донора и реципиента; 2) определить резус-принадлежность крови реципиента; 3) поставить пробу на групповую совместимость крови донора и реципиента; 4) поставить пробу на резус-совместимость крови донора и реципиента; 5) провести биологическую пробу.

Иммунологические методы диагностики. Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело. Принципы и методы иммуноферментного анализа. Получение иммунных антисывороток. Метки в иммуноанализе.

Иммунологические исследования — диагностические методы, базирующиеся на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для выявления возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний, определения гормонов, беременности, видовой принадлежности белков, опухолевых антигенов, диагностики аутоиммунных болезней, для определения групп крови и совместимости переливаемой крови. Иммунологические исследования позволяют не только идентифицировать различные вирусные, бактериальные или паразитарные заболевания, но также определять титры антител к ним, что позволяет оценивать устойчивость организма к отдельным видам инфекционных болезней и прогнозировать их развитие. С помощью иммунологических методов изучают иммунитет по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В основе этих методов исследований лежит реакция «антиген-антитело» с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в сыворотке крови (в пробирке) различными методами.

Антиген – это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию. Антигенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразиты, а также любые другие вещества из внешней или внутренней среды (пыльца растений, белки трансплантатов тканей и органов, поверхностные белки клеток крови при ее переливании и другие соединения). В некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов.

Антитела (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) – это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена. Антитела образуются против не всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с одним определенным антигеном. Кроме этого возможно получение искусственным путем антител, которые будут специфически связываться с другими антителами, что широко используется для создания различных диагностических тест систем. Сыворотка крови, содержащая антитела к другим антителам называется антисывороткой.

С помощью иммунологических исследований решаются две основные задачи:

Определение антигенов. Когда неизвестным компонентом реакции является антиген. Для его обнаружения в исследуемом материале используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие высокоспецифичные антитела, которые были получены от животных после их вакцинации определенными антигенами.

Определение антител. В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в иммунологических или, как их еще называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных к примененному антигену. При исследовании антител к инфекционным заболеваниям, например к лептоспирозу или токсоплазмозу, достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала анализируют кровь больного, взятую в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу и на основании динамики нарастания антител ставят окончательный диагноз.

Иммунологические реакции протекают в две фазы:

Специфическое связывание антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.

Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело. Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов. Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.

В зависимости от механизма и учета результатов иммунологические методы исследования подразделяют на: реакции, основанные на явлении агглютинации; реакции, основанные на явлении преципитации; реакции с участием комплемента; реакции нейтрализации, реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализы).

Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело:

Процесс соответствующих взаимодействий, имитирующих те, которые доминируют в биохимических процессах и относящихся к нековалентным, получил название "молекулярное узнавание". Молекулярное узнавание можно определить как процесс, включающий в себя как связывание, так и выбор молекулы – "гостя" данной молекулой -"хозяином". Просто связывание молекул не является молекулярным узнаванием. Согласно Лену , "узнавание – это связывание с целью". Данное поведение характерно для многих биохимических процессов, таких как ферментативные реакции, связывание "рецептор-субстрат", сборка белковых молекул, иммунное взаимодействие антиген-антитело, транспорт через мембрану и т.д. Одним из критериев молекулярного узнавания является то, что константа ассоциации между "хозяином" и "гостем" является значительно более высокой по сравнению с константами образования комплексов между другими молекулами, присутствующими в системе. В связи с этим особое значение приобретает исследование энергетики межмолекулярных взаимодействий биомолекул. Энергетические параметры позволяют судить о силе взаимодействия, наличии или отсутствии ассоциации между молекулами, а также выявить и описать влияние растворителя на процесс молекулярного узнавания.

Иммуноферментный анализ – наиболее надежный, экономичный и высокочувствительный метод, применяемый для количественной оценки антител и антигенов. Его отличает простота проведения реакции, возможность инструментального учета и автоматизации всех ее этапов.

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

ИФА основан на использовании антител, конъюгированных или связанных с ферментами, в основном пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Комплексы антител с ферментами называются конъюгатами. Механизм реакции при определении антигена заключается в следующем:

На твердый носитель, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антитела к искомому веществу или инфекционному агенту. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. Затем несорбированные белки отмывают специальным раствором и в лунки добавляют исследуемый материал, например сыворотку крови, где находятся искомые антигены (вирусы или бактерии и т.д.). Антитела, закрепленные на пластиковой подложке, «подбирают» антигены, присутствующие в крови пациента, специфически с ними связываясь. Затем добавляют антитела, связанные с ферментом – конъюгаты. Оставшиеся молекулы сформируют «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное на подложке антитело —антиген — связанное с ферментом антитело.

Чтобы обнаружить образовавшиеся иммунные комплексы, т.е. соединения меченых антител с антигенами, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к антителам ферментом. После добавления в данную систему хромогенного субстрата последний расщепляется ферментом конъюгата, в результате чего изменяется цвет раствора в лунке.

Интенсивность окрашивания пробы исследуемого материала прямо пропорциональна содержанию в ней искомого антигена. Учет интенсивности реакции опытных и контрольных проб проводят на основании измерения оптической плотности на специальных приборах – спектрофотометрах. Чем выше оптическая плотность в данной ячейке, тем большее количество специфических антител содержится в пробе.

В случае, когда неизвестным компонентом является антитело, первая реакция происходит между искомым антителом и очищенным антигеном возбудителя, фиксированным на поверхности лунок планшета. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую реакцию, в которой в качестве антигена выступает специфически связавшееся антитело, а в качестве антител к нему — конъюгат. Это вариант непрямого иммуноферментного анализа. Например, с помощью этого вариант ИФА определяют антитела к токсоплазмозу – паразитарному заболеванию кошек, собак и человека.

В последнее время все более широкое распространение в ветеринарии получили экспресс-тесты диагностики инфекционных заболеваний. Экспресс-тесты не требуют специальной длительной подготовки проб, просты в применении, отсутствует необходимость в использовании дополнительных реагентов и оборудования, поскольку все иммунореагенты находятся в составе тест-кассеты. время исполнения анализа не более – 15-25 минут. И в то же время этот метод достаточно надежен – достоверность достигает 92-98%. Их можно применять в любом месте: в кабинете, при выезде на дом, в лаборатории. Иммунохроматографические диагностические методы являются позднейшей разработкой, отвечающей всем требованиям, и наиболее широко используемыми в мире диагностическими экспресс-методами.

От наличия возможности быстро обнаружить возбудителя инфекционного заболевания может зависеть здоровье и жизнь животного, поэтому быстрая диагностика позволит назначить адекватное лечение в минимальные сроки.

Принцип работы экспресс-тестов основан на методе иммунохроматографии (ИХА), сущность которого заключается в следующем: при нанесении исследуемого образца жидкости (сыворотка крови, смывы со слизистых) на специальную нитроцеллюлозную мембрану на которой закреплены специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены), раствор с исследуемым биологическим материалом проходит вдоль мембраны за счет капиллярных сил. В случае присутствия в исследуемом материале тестируемого антигена или антитела происходит связывание с агентами на подложке (мембране). В результате чего на мембране появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста.

Наиболее известны диагностические иммунные сыворотки (антисыворотки), с помощью которых выявляют Аг возбудителей в клиническом материале, а также проводят серологическую идентификацию микроорганизмов из выделенных культур. Для установления принадлежности микроорганизмов к конкретному виду применяют видовые антисыворотки (AT). Для распознавания Аг, общих для групп микроорганизмов одного вида, применяют групповые антисыворотки (AT). Серовароспецифичные антисыворотки позволяют различать серологические варианты (серовары) микроорганизмов в пределах одного вида.

Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7 – 9-й день после последней инъекции.

Метки в иммуноанализе:

• 1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА).
• 2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность – анализ иммуноферментно-флюоресцентный.
• 3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.

В случае РИА результат измеряют на счетчиках радиоактивности в зависимости от того, какие частицы/кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без соответствующих приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность. При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на флюориметре, измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн.